Espectrofotometria

A espectrofotometria pode ser definida como toda técnica analítica que usa a luz para medir as concentrações das soluções, através da interação da luz com a matéria.

A palavra espectro de origem grega foi empregada para nomear raios luminosos em virtude de na antiguidade as pessoas sepultarem seus mortos em covas rasas, e o simples fato de alguém desavisado pisar em cima, de uma dessas sepulturas fazia com que o gás metano fosse expelido, visto que corpos em decomposição liberam diversos gases, entre eles o metano, que apresenta uma propriedade de auto inflamar-se apresentando um aspecto luminoso intenso. Quando alguém era surpreendido por uma bola gasosa dessa ficava assustado e dizia estar sendo assustado por um fantasma que em grego é espectro.

Fundamento da espectrofotometria

A luz de uma maneira geral é mais bem descrita como sendo uma radiação eletromagnética  em virtude de sua natureza dualística. Ou seja, ela existe e tem um comportamento de campos elétricos e magnéticos oscilantes como a figura abaixo representa:

Onde:

O comprimento de onda (λ) é distancia em metros, de um pico ao outro da onda;

A frequência (v) é o grau de oscilação das ondas, em função da velocidade da luz no vácuo que é representada pela constante c (c=2, 998×10⁸m. s^-1). De modo que:

λ . v = c

Espectro eletromagnético representando os comprimentos de onda correspondente a cada radiação

A técnica espectroscópica é baseada na no aumento de energia em função do aumento da frequência da radiação incidida. Quando uma espécie química absorve energia na forma de fótons, seus elétrons ficam excitados e ocorre uma transição de um orbital de mais baixa energia para outro de maior energia. Um exemplo disso são compostos químicos que apresentam duplas ligações C=C no benzeno e C=O, a carbonila, por exemplo.

Benzeno

As cetonas da ligação peptídica

O aumento de energia é representado pela condição de frequência de Bohr:

E = hv

Onde:

E é a energia que aumenta em função da frequência, e h é a constante de Planck h=6,626×10^-34J.s.

A transição eletrônica de duplas ligações, ocorre em virtude de uma ligação dupla ser formada por um orbital sigma (σ) e um orbital (π), de modo que o elétron que está no orbital pi ligante vai para o orbital pi antiligante que tem maior energia. (para detalhes maiores vide teoria do orbital molecular).  A transição nas C=C é na C=O é representada na figura abaixo, essa espécies químicas são denominadas cromóforos ou substâncias que trazem a cor:

Para C=C : π-π*

Para C=O : (orbital não-ligante) n-π*

Aminoácidos como a Fenilalanina, Tirosina e Triptofano são os principais responsáveis pela absorção de luz das proteínas em virtude de possuírem o anel benzênico em sua estrutura química, além da ligação peptídica listada acima. A luz é absorvida na faixa de 280nm.

Lei de Lambert-Beer

A “força vital” da espectrofotometria está fundamentada na lei de Lambert-Beer, que estabelece:

“A absorbância é diretamente proporcional a concentração da solução de amostra.”

Ou:
Log(I/I₀)=εcl
A= εcl

Onde :
A é a absorbância,
ε é o coeficinte de extinção molar e
l é o comprimento da cubeta.

Os componentes principais de um espectrofotômetro são apresentados e suas respectivas funções:

Fonte de Luz: é composta por uma lâmpada de deutério e uma lâmpada de tungstênio (semelhante à lâmpada de carro). A lâmpada de deutério emite radiação UV e a de tungstênio emite luz visível.

Monocromador: alguns espectrofotômetros ainda possuem um prisma como monocromador, porém os mais modernos possuem dispositivos eletrônicos que transformam a luz incidida em vários comprimentos de onda, em um só comprimento, ou seja, a luz monocromática.

Cubetas utilizadas em espectrofotometria. Geralmente usa-se cubeta de 1 cm, a fim de facilitar os cálculos da Lei de Lambert-Beer.

Cubeta: é o recipiente propício para conter a amostra que será utilizada na análise, as cubetas podem ser de quartzo, vidro e acrílico, porém recomenda-se que seja usada uma cubeta de quartzo por que o vidro e o plástico absorvem UV e causa a reflexão da luz visível.

Detector: o detector é um dispositivo que detecta a fração de luz que passou pela amostra e transfere para o visor e para o computador acoplado ao aparelho.

Análise espectrofotométrica

Passo 1: a amostra deve ser preparada com a quebra da amostra por métodos mecânicos, químicos ou físicos;

Passo 2: a amostra é solubilizada no solvente escolhido em um balão volumétrico limpo e seco;

IMPORTANTE: o solvente na maioria das vezes é água, porém, quando tratar-se de amostras apolares que precisam ser diluídas em solvente orgânico nunca utilize alcenos, alcinos, cetonas ou qualquer outro que tenha ligações C=C ou C=O ou triplas.

Passo 3: em uma cubeta é colocado o solvente puro e lido no comprimento de onda o mesmo que será lida a amostra, esse procedimento é chamado leitura em branco, e tem como finalidade minimizar os erros causados, pela absorção luz ocasionados pelo vidro e pela água;

Passo 4: a amostra é filtrada em uma membrana de 0,2 μm, por que a solução deve estar totalmente límpida a fim de diminuir ao máximo o erro causado por partículas em suspensão, a cubeta contendo o branco e retirado do equipamento e sua absorção anotada. Após esse processo a solução de interesse é lida, e dessa absorbância é subtraído a leitura do branco.

Cuidados em espectrofotometria

• É imprescindível que o equipamento seja calibrado e manuseado de acordo com as instruções do fabricante, por ele já traz a margem de erro que o aparelho tem;
• Evitar erros de leitura certificar-se de que o equipamento esteja fechado. Antes da leitura a luz do ambiente pode interferir no resultado;
• Manter sempre limpo e fechado a fim de evitar o acumulo de partículas de poeira que interferem na análise. Em hipótese alguma toque a cubeta com as mãos sem luvas, a nossa mão contém gorduras e interferem na leitura.
• Só podem ser analisados por espectrofotometria de absorção compostos que absorvem luz.
• Em caso de soluções fortemente coloridas como permangantos, complexos altamente coloridos, dicromatos, cromatos e outros compostos com cores altamente acentuadas deverão ser feitas no mínimo 5 diluições de concentração conhecida e lidas no espectrofotômetro e uma curva analítica deverá ser traçada afim de determinar o coeficiente de extinção molar. Soluções muito concentradas tendem provocar erros de leitura por que existem muitas moléculas próximas umas das outras.